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面向POCT應用的微流控芯片技術

體外診斷技術支持2020-07-23 09:47:51

即時檢測(point-of-care testing, POCT)以實現便捷的現場即時醫學檢測為主要思想,旨在借助一體化檢測器或便攜式儀器,縮減樣本運輸管理成本,降低檢測等待時間,緩解臨床應用對高端儀器的依賴。相對于傳統的實驗室檢測機制,POCT不單純以提高檢測精度為目標,而主要通過精簡操作流程、集成檢測裝置、壓縮檢測成本,實現部分由非專業人員完成、受眾和適應性更強的就地檢測。因其綜合成本和可操作性方面的優勢,POCT對完善農村邊遠地區醫療建設、加速檢驗檢疫流程、應對突發疾病災害、推動個性化醫療和疾病篩查等具有重要意義,并已廣泛應用于臨床治療和監護。20世紀90年代初提出的微流控芯片(microfluidic chip)技術依托現代微加工工藝,可實現采樣、稀釋、加試劑、分離、檢測等實驗流程和生化反應在單片平板芯片上的集成,從而減少樣品試劑消耗、提高檢測靈敏度、縮短反應時間、降低平均成本。其可滿足從生物小分子到細胞的不同尺度對象檢測需求,并可通過在后端耦合光、電、熱等形式的檢測器和讀數裝置,實現檢測流程的自動化和檢測結果的信息化。微流控芯片微型化、集成化、自動化的特性,高度切合POCT檢測技術的發展需求,對優化臨床檢測具有重要意義,近年來已日趨成為POCT領域的研究熱點和核心技術。

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1 POCT 微流控芯片核酸檢測

由于核酸是儲存、復制和傳遞遺傳信息的基礎物質,因此,核酸檢測在特定疾病的檢測中具有較高的靈敏度和特異性。傳統的核酸檢測包括樣品前處理、核酸擴增(PCR擴增)及擴增產物的檢測等多個復雜、耗時的步驟,對操作人員有特殊要求,同時需要使用到昂貴的設備和試劑。核酸芯片可以將這些處理過程微型化、簡潔化,并統一集中在一個微小芯片內。由于核酸檢測處理過程復雜,不同步驟中需要使用多種試劑,因此核酸芯片的流體控制系統比較復雜。此外,PCR擴增過程中的溫度控制系統,以及擴增產物的光學檢測系統和最終輸出檢測結果的用戶接口都有較高的整合性要求。對于POCT核酸檢測而言,需要對功耗、體積、可靠性和成本等多方面進行考慮。目前,已經發表的多種技術和方法都有各自的優勢和缺陷,針對不同的檢測目標和應用場合,有的方法注重檢測速度,有的注重多重檢測、高通量,有的則強調定量檢測??傮w來說,高功耗和大體積是目前的核酸芯片檢測系統面臨的主要問題,未來的POCT核酸檢測需要進一步完善便攜性,并保證核酸檢測原有的高靈敏度和高特異性的優勢。

POCT 核酸芯片


針對POCT核酸芯片擴增產物的檢測方法,除了常規的熒光檢測和電泳檢測外,還有幾種新的發展趨勢。低密度微矩陣核酸雜交法(low-density microarray)可以實現同時檢測多個擴增產物。整合引物延伸方法(integrated primer extension assay)是檢測目標基因的單個核苷酸多態性(single-nucleotidepolymorphisms,SNPs),這種方法快速、簡便、成本低。側流層析試紙法(lateral-flow strip)的原理與免疫側流層析試紙條技術相似,采用特異性的寡核苷酸捕捉擴增后的核酸,再與標記有膠體金的特異性的寡核苷酸結合,這種方法芯片成本低,結果易于判讀,可半定量或定量檢測。


2 POCT 微流控芯片蛋白質檢測


蛋白質通??梢灾苯咏沂净蚍从衬承┐_切疾病的表征和狀態,因此蛋白質檢測是POCT目前研究較多的方面。蛋白質檢測不需要對樣品進行前處理,可以直接對全血和唾液進行檢測。其中以免疫層析法為原理的蛋白質檢測較為普遍,該方法具有較高的靈敏度和特異性,而且相比于核酸檢測更加簡單和快速。綜合各類商業應用和學術研究的POCT蛋白質檢測,主要特點都是盡量減少樣品處理步驟和相關的流路控制,為非專業的操作人群提供操作更簡單、重復度更高的檢測系統。目前,研究一些新的流路控制方法和新材料,如表面等離子體諧振(SPR)、磁性納米材料、量子點材料等,改進蛋白質檢測的集成度和檢測效率是POCT重要的發展方向。




蛋白質通??梢灾苯咏沂净蚍从衬承┐_切疾病的表征和狀態,因此蛋白質檢測是POCT目前研究較多的方面。蛋白質檢測不需要對樣品進行前處理,可以直接對全血和唾液進行檢測。其中以免疫層析法為原理的蛋白質檢測較為普遍,該方法具有較高的靈敏度和特異性,而且相比于核酸檢測更加簡單和快速。綜合各類商業應用和學術研究的POCT蛋白質檢測,主要特點都是盡量減少樣品處理步驟和相關的流路控制,為非專業的操作人群提供操作更簡單、重復度更高的檢測系統。目前,研究一些新的流路控制方法和新材料,如表面等離子體諧振(SPR)、磁性納米材料、量子點材料等,改進蛋白質檢測的集成度和檢測效率是POCT重要的發展方向。

Alere的Triage POCT 系統和檢測盒


美國AlereTriage系統是比較成功的免疫層析POCT商業產品,該系統可直接通過全血高效檢測急性心肌梗塞相關標志物。該系統采用聚合物微流控通道代替傳統的硝酸纖維膜,使得液體遷移的重復性和穩定性都得到了極大的提高。此外,該系統利用疏水材料控制樣品流速,并利用熒光染料替代傳統的膠體金作為標記物。


除了免疫層析法外,酶聯免疫吸附實驗法(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)也是近年在蛋白質檢測上研究較多的方法。Laksanasopin等人研發的智能手機電子狗(Dongle)復制了實驗室ELISA所有的機械,光學和電子功能,由手機提供電量。該系統在15分鐘內完成三重免疫檢測:同時檢測HIV抗體,梅毒螺旋體特異性抗體和針對梅毒的非螺旋體抗體。檢測結果與目前臨床的算法需求相一致,并且可以直接在手機界面完成顯示和存儲。

基于ELISA的POCT電子狗


3 POCT微流控芯片細胞計數與檢測

細胞作為生物有機體結構和功能的基本單位,可以直接反映疾病的進行情況,如在口腔癌、艾滋病等的輔助診斷和預后判斷方面有重要的臨床應用價值。POCT細胞檢測是對核酸檢測和蛋白質檢測技術的重要補充,其分析方法主要是細胞分離和分型計數,即傳統的流式細胞儀技術。目前,POCT細胞檢測在對操作人員的要求、檢測速度和量產成本等方面都有很大的發展空間,研究新的細胞分離技術和檢測方法是當前的研究熱點。隨著物聯網技術的興起,具備遠程診斷功能的POCT將會很快成為主要的發展趨勢。

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Zhu等人設計了一套可安裝在手機上的成像組件用于計數紅細胞、白細胞和測量血紅蛋白濃度。其中白細胞在熒光標記后,用特定激發光和手機的攝像頭進行檢測;紅細胞在全血用PBS1:1000稀釋后,在明場照明下進行檢測。該裝置的檢測效果與SysmexKN21血液分析儀的相關系數達到了0.98。像這樣與手機集成的POCT細胞檢測技術利用廉價的光學元件和簡單的樣品處理流程,就能對血細胞取得很好的計數效果,并且易于通過手機通信實現遠程診斷。



除光學檢測方法外,電化學阻抗法是POCT細胞檢測的另一個研究方向。其原理是通過測量細胞膜的容抗和阻抗,以及細胞質的電導率和電容率,實現對血細胞的計數和區分不同的白細胞。該方法不需要對細胞進行標記,成本低,且易于和IC工藝集成,有利于后期的信號處理。Morgan和他的同事設計的細胞芯片通過兩個電極間的交流電壓和導通電流的比率來測量單個細胞的阻抗。

由于CD4 + T細胞數量可以反映艾滋病感染者免疫系統的功能水平,目前已經有一些商業型的CD4 POCT診斷系統,但其集成度和成本等還遠不能滿足發展中國家對HIV監控POCT的迫切需求。CyFlowminiPOC是臺式流式細胞儀的POCT版,可以提供CD4的絕對數量和CD4%。儀器采用干的單克隆CD4抗體試劑用于捕獲/凈化CD4細胞,保存時間達6個月且無需低溫運輸。但是該儀器需要操作人員提前對樣品進行多步處理后才能完成檢測。AlerePima CD4分析儀采用一次性檢測筒,只需要25 μL指尖血液樣本或靜脈血樣本就可以在20分鐘內完成CD4計數。DaktariCD4分析儀利用固定住的抗體捕獲和分離CD4細胞,然

后使得細胞裂解,檢測細胞內的物質釋放出來后引起的阻抗變化。該方法在200,350500個細胞/μL下靈敏度分別達到了0.86,0.900.97,特異性均達到了0.94。


4 POCT 微流控芯片關鍵技術

4.1 微流控芯片POCT 儀器構建技術

為方便儀器研制和最大限度地壓縮生產成本,面向POCT應用的微流控芯片主要選用PDMS(polydimethylsiloxane)、PMMA(polymethylmethacrylate)、COC(cyclic olefin copolymer)等聚合物材料為基材,通過等離子體鍵合、犧牲層鍵合、紫外鍵合、溶劑鍵合等工藝,實現功能物質的附著。由于具有優良的熱塑性和可加工性,PMMA、COC等材料可采用壓?;蜃⑺芄に囘M行低成本的基片加工,成為較流行的微流控芯片材料。通過利用PMMA透明的特點,可實現對細胞或生物大分子的直接觀察,利于后端微流控芯片光電檢測器的設計,如Kurkuri等采用PMMA材料設計了等離子體功能化的微流控芯片,利用其與EpCAM(anti-epithelial-cell adhesionmolecule)的結合,實現對NCIH69肺癌細胞和SK-Br-3胸腺癌細胞的捕捉,并可直觀觀察內部3D結構的細胞捕獲過程。此外,也可利用印制電路板技術成熟、加工精度高、成本較低的特性,設計基于印制電路板的微流控系統。

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微流控芯片可滿足生物分子和細胞的檢測需求,但在臨床應用中微流控芯片POCT儀器主要以人體體液為直接檢測物質。為實現便捷性操作和定量檢測,以微針技術(microneedle)為代表的微創采樣技術已成為POCT用微流控芯片的研究重點之一。通過采用X光刻蝕、離子蝕刻、熱模壓、濺射淀積等工藝,可構建直徑僅數十微米的微針,實現表皮穿刺和血液采樣[40]。Li等采用光刻工藝構建外徑120 、內徑60、長度1800的微針結構,在分析機械強度和液體采樣效果的基礎上,通過激光切割傾角的針尖,可在保障穿刺性能的基礎上減少血管損傷和神經接觸。


此外,隨著納米技術的發展和普及,以納米金顆粒、納米磁珠、納米線等為代表的納米材料近年來已開始用于微流控芯片POCT檢測,對擴大POCT適用檢測范圍、實現檢測物質分離和活體在線監測等具有重要意義。


4.2 微流控芯片POCT 儀器系統化設計

微流控芯片POCT儀器圍繞單個芯片,實現從定量采樣到結果輸出的全流程測試功能。為同時滿足臨床實用和便捷操作的需要,需綜合考慮各功能單元布局和完善系統可操作性:一方面,需針對前端微流控芯片設計并整合進樣、分離、檢測等單元;另一方面,需針對用戶和市場需求,合理設計后端用戶和信息化接口。對前端微流控芯片,可針對樣本和芯片基材的流體特性,選用壓力泵驅動、微電機離心驅動、微電極電濕潤驅動、紙基芯片毛細驅動等方案,實現進樣驅動[45]。對以血液為代表的復雜成分檢測樣本,可根據目標物質的理化特性,選用介電泳分離、磁分離、水作用力分離、過濾結構分離等方案實現定向提取。其中,由于納米磁珠的良好分離性能和生物相容性,近年來被廣泛應用于細胞POCT檢測分離。檢測原理方面,通常采用光電檢測和電化學檢測。其中電化學檢測可采用未加工工藝,以光刻蝕、離子沉淀等方式在芯片內部直接加工微電極。光電檢測則通常選用激光二極管為光源,采用光電倍增管、CCD(Charge Coupled Device)實現定量檢測或目標成像。

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對后端用戶和信息化接口,通常采用低功耗、低成本的單片機或ASIC(application specific integrated circuit)作為中低端POCT儀器優先選擇的技術方案。近年來隨著低功耗通用處理器和移動計算技術的發展,部分中高端POCT儀器以嵌入式系統為核心組織系統。對于血糖檢測等家用、自主式POCT應用,部分研究者采用智能手機、平板電腦等消費電子產品為用戶終端,可實現對POCT檢測數據的讀取、顯示、上傳、管理。


4.3 微流控芯片POCT 儀器產品

以血糖儀和血液分析儀為代表,Abbott、Johnson & Johnson、HemoCue、Chempaq、Advanced Liquid Logic、Epocal、TearLab等廠商已陸續推出了若干面向臨床的微流控芯片POCT儀器產品。Abbott公司的i-STAT床旁血液監護系統是該領域研發起步較早的代表性產品,20世紀80年代開始即進入FDA(Food and Drug Administration)技術認證階段。其采用卡式結構設計,支持血液中血氣、電解質、血凝、生化及心肌標志物等監測,可在2分鐘內輸出檢測結果。HemoCue公司和Chempaq公司開發的血液分析儀器,僅需10μL量級的血液樣品,即可實現對血液參數的快速精確測定,可滿足社區醫院和診所的醫學檢測需求。從行業發展趨勢來看,微流控芯片POCT儀器日趨向著高靈敏度、多功能化、便攜化等方向發展,但隨著歐美等國對POCT行業監管力度的加大,短期內該領域所面臨的主要商業化和產品化問題是如何建立有效的行業規范,并通過日益嚴苛的資質認證。


5 研究難點與前景展望

微流控芯片由于其集成度高、準確度好、試劑消耗低、反應速度快等先天優勢,日趨成為構建POCT系統的核心技術。且受益于微加工技術的迅速發展,其有望提供一體化的復雜檢測和診斷功能。然而,受限于系統思維或行業體制,基于微流控芯片的POCT系統研究和產品化仍存在諸多問題亟待解決:(1)系統集成問題,目前該領域研究普遍側重單一關鍵技術的突破,而面向復雜應用的系統設計方興未艾,為滿足腫瘤早期篩查、體液多成分檢測等臨床需求,需在單片微流控芯片上集成樣品微量量取、順序混合反應、分離分析和檢測等功能,并合理化設計閥、液路、反應池等單元;(2)易用性問題,基于微流控芯片的POCT儀器主要面向初級技術人員或無技術背景人員,需進一步完善其操作的簡易性,強化其對使用環境的適應性,降低因操作不熟練導致的不精確或錯誤檢測結果,提高儀器檢測結果的可靠性;(3)質量控制問題,POCT儀器的臨床應用尚缺乏成熟的行業規范和管理體系,檢測結果較高的不確定性限制了其推廣和用于臨床決策。

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隨著新材料技術的發展和信息化水平的提高,微流控芯片POCT儀器在功能深度和應用廣度上將會有更大的提高。(1)芯片紙基化,傳統的微流控芯片通常采用光刻蝕加工玻璃、硅片、高分子聚合物等基材,制備過程復雜,研發成本高。采用蠟印技術構建微通道的一次性紙基微流控芯片,重量和成本進一步降低,對發展資源匱乏條件下的現場實時診斷具有廣闊應用前景。(2)設備信息化:隨消費電子產品和無線網絡技術的迅速普及,為實現微流控芯片POCT儀器與家用信息系統聯用,以及大數據背景下的遠程醫療和個性服務,提供了巨大的機遇和挑戰。(3)產品多樣化,通過利用碳納米管、量子點、金納米材料等新材料特性,微流控芯片POCT儀器的檢測診斷對象由現有的血糖、肺結核、HIV、心臟標志物等向外大幅延拓,有望覆蓋體育競技、海關口岸、應急輔助醫療等諸多領域。


參考資料:

1. 陳寒柏. 體外診斷行業之POCT。

2. R S, Z H, P T, et al. Development of adigital microfluidic platform for point of care testing.

3. 張玲. 即時檢驗(POCT) 的應用.


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