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實驗室如何檢測寨卡病毒?

儀器信息網2020-01-28 12:05:59

Zika Virus

  寨卡病毒(Zika Virus)屬黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus),呈球形,直徑約為40-70nm,有包膜?;蚪M為單股正鏈RNA,長度約為10.8Kb,可分為亞洲型和非洲型兩個基因型。

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1檢測對象

(一)疑似和臨床診斷病例。

(二)伊蚊成蚊和幼蟲。


2樣本采集、保存和運輸

(一)病例標本采集。

  對懷疑感染寨卡病毒的患者,推薦采集血清標本開展檢測。

用無菌真空干燥管,采集患者非抗凝血5mL,及時分離血清,分裝2管,保存于帶螺旋蓋、內有墊圈的凍存管內,標記清楚后低溫保存,其中1管用于現場實驗室檢測,1管用于上級疾病預防控制機構復核。

  對病例應盡可能采集雙份血液標本,兩份標本之間相隔14天為宜,住院病例可于入院當天和出院前1天各采集一份。

(二)蚊媒標本采集。

  疫點內采集的伊蚊成蚊及幼蟲,分類鑒定后,填寫媒介標本采集信息表,按照采集地點分裝,每管10-20只。

(三)標本保存、運送。

  如標本能夠在24小時內開展實驗室檢測,應將標本置于2-8℃保存;如能在7天內開展檢測,應將樣本置于-20℃保存;如需保存7天以上,應將樣本置于-70℃以下。

  標本運送時采用低溫冷藏運輸,避免凍融,樣本運輸應遵守國家關于三類病原體的相關生物安全規定。


3檢測方法

  寨卡病毒病的檢測方法包括病毒核酸檢測、IgM抗體檢測、中和抗體檢測和病毒分離等。寨卡病毒與黃病毒屬其他病毒具有較強的血清學交叉反應,目前主要采用病毒核酸檢測。

開展蚊媒寨卡病毒檢測時,對捕獲的伊蚊成蚊或幼蟲進行病毒核酸檢測。

  開展寨卡病毒實驗室檢測時,應同時考慮登革病毒和基孔肯雅病毒感染可能。登革病毒和基孔肯雅病毒實驗室檢測應按照相應的技術指南開展。

(一)臨床標本檢測

1.病原學檢測

病原學檢測主要適用于急性期血液標本,一般認為發病7天內檢測陽性率高。

(1)核酸檢測:采用熒光定量RT-PCR方法,是目前早期診斷寨卡病毒病的主要檢測手段。

(2)病毒分離:將標本接種于蚊源細胞(C6/36)或哺乳動物細胞(BHK21、Vero)進行分離培養,出現病變以后,用檢測核酸的方法鑒定病毒。也可使用乳鼠腦內接種進行病毒分離。

2.血清學檢測

(1)血清特異性IgM抗體:發病3天后可檢出病毒特異性IgM抗體,但發病7天后檢出率高??刹捎肊LISA、免疫熒光等方法檢測。IgM抗體陽性,提示患者可能新近感染寨卡病毒,但寨卡病毒IgM抗體與登革病毒、黃熱病毒和西尼羅病毒等黃病毒有較強的交叉反應,易于產生假陽性。

(2)中和抗體:采用空斑減少中和試驗方法檢測?;颊呋謴推谘逯泻涂贵w陽轉或滴度較急性期呈4倍及以上升高,且排除登革、乙腦等其他常見黃病毒感染,可以確診。

(二)媒介標本檢測

1.標本處理

將分類后的伊蚊成蚊或幼蟲,按照采集地點,每10~20只為一份進行研磨處理。

2.病毒核酸檢測

用RT-PCR的方法進行寨卡病毒核酸檢測

3.病毒分離

病毒核酸陽性的標本進行病毒分離。


4生物安全


  寨卡病毒在我國歸屬于三類病原體,應在生物安全二級實驗室(BSL-2)開展實驗室檢測。應按照《病原微生物實驗室生物安全管理條例》等相關規定要求,做好生物安全防護工作。

2014年以來美洲多個國家相繼發生寨卡病毒(Zika)感染病例,世界衛生組織近日警告,寨卡病毒正呈現“暴發式傳播”,預計美洲地區將有至多400萬人感染這種病毒。截至目前,中國大陸尚未發現病例,但疾病預防控制中心指出我國仍存在病例輸入風險。


  目前關于這種病毒傳播的疑問不少,比如懷孕期間感染與造成嬰兒小頭畸形之間的關聯,但由于目前診斷方法的局限性,還很難給出一個答案來。一組研究人員正在攻關,希望能以最快的速度研發出免疫試劑,檢測是否感染Zika病毒。


  來自德州大學加爾維斯頓醫學分校的Nikos Vasilakis表示,“我們正盡全力盡快給臨床醫師們一些答案?!?/span>


  目前,檢測寨卡病毒的標準檢測方法是對樣本進行PCR,分析樣本中的病毒RNA探針是否存在,雖然這種方法能很好的檢測到病毒,但是病原體的RNA很快就會被降解掉。“在患者把樣品送入臨床時,病毒也許已經消失,或者只能抓住它的尾巴了,這超過了檢測時間限制,”Vasilakis說。

  臨床醫師和流行病學家希望能在出生前幾個月里就確定嬰兒是否感染了寨卡病毒,為此美國疾病控制與預防中心CDC的科學家們進行了一種稱為蝕斑減少中和試驗(Plaque Reduction Neutralization Test) 的檢測,這種方法是檢測血清中和抗體的一種敏感性較高的方法,能檢測之前的感染。


  從原理上說,這一檢測方法以使蝕斑數減少50%的血清稀釋度作為其中的效價。試驗使用定量的病毒(100PFU)與不同稀釋度的等量血清混合后感作, 接種預先準備好的單層細胞,再覆蓋上營養瓊脂置37度二氧化碳培養箱培養,數天后分別統計蝕斑數,用Karber法計算該血清的蝕斑中和效價。


  患者的血清中混有病毒,幾天時間里研究人員觀察病毒是否會感染培養基,如果沒有,那么病毒就已經被血清中的抗體中和了,這表明患者曾經接觸過寨卡病毒。


  CDC甲類病毒實驗室主任Ann Powers表示,使用這種方法的問題在于“你必須有活體病毒,和合適安全的環境,”這意味著只有少數幾個實驗室能進行這種試驗。


  其它更加方便的血清學測試也能檢測特定病原體中的抗體,但是對于寨卡病毒來說,很難判斷患者攜帶的黃病毒是登革熱病毒,寨卡病毒還是其它病毒?!岸艺ú《境鋈サ膮^域也正是登革熱出現的地區,”來自華盛頓大學圣路易斯分校的免疫學家Mike Diamond說。


  Vasilakis 正在嘗試ELISA方法,也就是檢測體液中微量物質的固相免疫測定的方法,這種方法利用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接,然后通過酶與底物產生顏色反應,用于定量測定,可以在感染后幾個星期內檢測到Zika病毒。雖然這也有可能會與其它感染發生一定程度的交叉反應,但如果Zika病毒特異性抗體濃度高就能指示出近期發生的Zika病毒感染,Vasilakis說。


  Vasilakis預計在未來幾周內,Diamond研究組就會有結果,研發出一種針對Zika病毒的單克隆抗體檢測方法,這能與ELISA方法結合,檢測發生過的感染,“我們很早就開展了這項研究,這個月就能得到結果,”Diamond說,“初步結果表明我們的一些抗體能特異性識別Zika病毒?!?/span>


  不過即使Diamond研究組的抗體能特異性檢測Zika病毒,他們也需要一些時間來建立診斷方法,“這可能還需要幾個月的時間?!?/span>


  與此同時,一些生物公司也開始銷售Zika血清學檢測,比如MyBioSource 公司已經有售一種針對Zika的IgM ELISA檢測,來自加拿大的Biocan 公司也在出售一種檢測IgM和IgG抗體(后者比前者在感染后提升水平更高)的扎手指檢測方法,能在5到10分鐘得到結果。

  Diamond表示他們還未接觸任何商業產品,Biocan目前還未給出有效數據,但是其銷售部總經理Bhavjit Jauhar表示他們已經將實驗室和現場檢測結果呈遞給巴西監管當局,“我們過去幾年間一直致力于Zika病毒的研究,因為我們認為這種疫情會暴發?!?/span>

本文來源:綜合現代檢驗醫學雜志&國際檢驗醫學雜志,侵刪


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